以自制花椒麻味物质为标样
2、高效HPLC标准曲线的液相绘制
按上述色谱条件，以自制花椒麻味物质为标样，色谱进行HPLC检测，定量的建样品有三个主峰，检测保留时间在22～24min之间，花椒含量如图4所示。麻味再将标准品(55μg／mL)用甲醇将其配制成一系列梯度的物质花椒麻味物质标准使用液(μg／mL)：0、10、高效20、液相30、色谱40、定量的建45。检测分别精密量取20μg标准使用液进行高效液相色谱检测。花椒含量以保留时间在22～24min的麻味峰为目的峰，以其HLPC峰面积之和作为纵坐标，对应标样的浓度作为横坐标，绘制标准曲线(图5)。
算得出该曲线的回归方程为：y=421097x+73819(R2=0.9994)
3、高效液相色谱(HPLC)检测法的技术指标研究
（1）HPLC方法的检出限
本研究用高效液相色谱法检测花椒麻味物质的检出限(图6)。检出限附近的标准曲线为y=0.2623x+0.0l(R2=0.9716)，其标准差为0.0063；应用公式计算出该方法的检出限为0.0339μg/mL。
(2)方法的准确度
取4份已知花椒麻味物质含量的样品，再各分成两份，一份不加入花椒麻味物质标准品(A样)，另一份加入标准品(B样)。花椒麻味物质标准品的加入量分别为1.4、1.6、1.8、2.0μg/mL。应用上述HPLC法测定A、B样中花椒麻味物质的含量，测定结果如表l所示。当花椒麻味物质标准品加入量为1.4μg/mL时，回收率范围为87.8％～112.8％；加入量为1.6μg/mL时，回收率范围为90.0％～107.5％；加入量为1.8μg/mL时，回收率范围为94.4％～105.0％；加入量为2.0μg/mL时，回收率范围为98.0％～103.5％。
（3）方法的精密度
在检测条件：岛津LC-10AT型分析型高效液相色谱仪，HC-C18型色谱柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脱，10min70％甲醇和水溶液洗脱，柱温为35℃，紫外检测波长254nm。取10组均匀样品，预处理后分别采用HPLC法测定花椒麻味物质的含量，连续、精确重复测定lO次，测定结果见表2。10组数据的相对标准偏差(变异系数)均小于5％，其变动范围为0.20％～1.6l％，说明这一方法具有较好的重复性。
三、讨论
花椒麻味物质具有多种生理活性及食用价值，但对花椒有效成分的开发和利用方面仍不足，未充分发挥其优势。定量测定花椒麻味物质含量方法为花椒质量评价标准和食品工业中花椒原料的选择可提供一定的理论依据。目前用到的定量测试方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、气相色谱法、薄层层析法、近红外光谱法、紫外分光光度法以及基于甲醛滴定快速测定法。HPLC在物质含量的定量检测方面应用较为广泛，其原理为：通过检测器的响应信号和检测器中物质的含量与成正比，利用峰面积大小来反映溶液中溶质含量。目前，文献中用HPLC法对花椒麻味物质进行检测，检测方法中所采用的洗脱剂种类、色谱柱类型等都各不相同，考虑到实验条件、实验目的、色谱柱性能、价格等因素，我们在研究中选用了最常见、分离效果好、价格适中的HC—C18柱。
在预备实验中，用反相薄层层析法对花椒麻味物质进行分析研究，研究发现采用70％的甲醇和水溶液作展层剂能有较好的分离效果，因此在HPLC分析中，也以适量浓度的甲醇和水溶液作为流动相。研究发现，采用甲醇和水溶液的梯度洗脱时分离效果较好，根据数次实验后确定的流动相浓度为：初始浓度为溶液浓度为50％，结束时溶液浓度为70％。研究中发现柱温为35℃时，理论塔板数最高，洗脱峰时间间隔最大，花椒麻味物质含量在0～300μg／mL范围内，花椒麻味物质含量和响应峰面积具有较高的线性相关度。
综上所述，用上述方法，标准品和样品中的麻味物质出峰位置一致，目标峰无拖尾、无分叉、分离度高，说明高效液相色谱法能将花椒麻味物质从其他物质中较好地分离出来。通过HPIC对其进行检测该方法的技术指标：检出限为0.0339μg／mL，回收率87.8％～112.8％，重复性实验中花椒麻味物质含量的标准偏差的变动范围为O.20％～1.61％，该方法其准确度和精密度都较好。花椒麻味物质能定量来衡量花椒品质的优劣，为进一步研究花椒有效成分和花椒质量管理奠定了良好的理论基础，从而推动我国花椒产业化发展。
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